Sydney Bristow (Jennifer Garner) jobber som hemmelig agent for CIA-avdelingen SD-6. Etter hvert oppdager hun at avdelingen har ondsinnede hensikter, og blir derfor dobbeltagent for CIA, med sin egen far som sjef. Men hvem jobber for hvem? Hvem er egentlig faren? Og hvordan skal hun klare å holde dobbeltlivet sitt hemmelig?